治理之下，西域诸国大体上平安相处，渡过了六七十年的安定时期；匈奴自从呼韩邪单于归附朝廷后，北境也是一番太平景象。然而到了西汉末年，政治日益腐败，外戚王莽执政，朝廷对西域及匈奴的控制能力已经严重削弱，元始二年(2年)，车师后王姑句与来去胡王唐兜因不满戊己校尉与都护的欺辱，率部众逃入匈奴，即是西域将发生动乱的信号。王莽不仅没有及时安抚诸国，反而遣使至匈奴强索二人，会集诸国国王，当众杀之，激起西域诸国的愤怒。王莽代汉建新后，任意“贬易王侯”，西域诸国愈加瓦解。始建国五年(13年)，焉耆(王治今新疆焉耆西南)率先起兵，攻杀都护但钦，继而又在各国支持下，大败继任都护李崇。李崇率残部退守龟兹(王治今新疆库车)，数年而死，西域从此断绝与中原的联繫。其后西域诸国自相攻击，匈奴也乘机而入，役使西域诸国，莎车王贤也联繫邻近诸国抗击匈奴。建武十四年(38年)，莎车王贤与鄯善王安遣使贡献，俱言诸国苦于匈奴重敛，皆愿属汉，恳请復置都护。这是东汉时西域与中原的首次交往。光武帝刘秀因天下初定，百废待兴，无力西顾，因此拒绝所请。公元45年，车师后国等十八国皆遣侍子入汉，再次请求内属，光武帝厚礼遣回诸国侍子，但仍然拒派都护。三年之后，匈奴正式分裂为南北二部。南匈奴南下附汉，北匈奴逐渐向西北迁徙，企图控制西域，作为侵扰中原的基地。至明帝永平时(58～75年)，北匈奴利用西域诸国的争斗，坐收渔利，最终完全控制了西域，数次胁迫西域诸国攻掠河西地区，以致河西一带城门昼夜皆闭。东汉政府为了保障西北地区的安全，不得不重新考虑夺取西域的问题。在公元73年窦固击北匈奴的战役中，汉军占领伊吾，并设置宜禾都尉，驻兵屯守。伊吾是北匈奴侵扰中原的必经之地，也是匈奴进入西域的咽喉要道，汉军控制了伊吾，从而揭开了汉匈再夺西域的序幕。班超就是为了实现这一方略而出使西域的。